PDA

توجه ! این یک نسخه آرشیو شده میباشد و در این حالت شما عکسی را مشاهده نمیکنید برای مشاهده کامل متن و عکسها بر روی لینک مقابل کلیک کنید : رنگ آمیزی گشترش های خون محیطی



casper
01/08/2010, 18:59
رنگ آمیزی گسترش های خونی

اصول رنگ آمیزی گسترشهای خونی بدین ترتیب است که رنگهای مورد استفاده معمــولاً دو نوعند: اسیـــدی و بازی. رنگهای اسیدی با قسمتهای بازی سلول مانند سیتوپلاسم ترکیب شده ولذا این قسمتها اسیدوفیل هستند. رنگهای بازی با قسمتــهای اسیدی سلول (مانند هسته) ترکیب شده ولذا این قسمتها بازوفیل هستند. قسمتهایی از سلول که با هر دو رنگ اسیدی و بازی ترکیب می شوند، نوتروفیل می باشند.

رنگهایی که برای رنگ آمیزی گسترشهای خونی بکار میروند بطور کلی رنگهای رومانوفسکی نام دارند. در رنگهای رومانوفسکی اولیه متیلن بلوی کهنه یا رسیده به عنوان رنگ بازی و ائوزین به عنوان رنگ اسیدی بکار میرفت. امروزه دو ترکیب عمدة رنگهای رومانوفسکی عبارتند از: آزورB (تری متیل تیونین) به عنوان رنگ بازی و ائوزینY (تترا برومو فلوروسئین) به عنوان رنگ اسیدی.

خاصیت مهم رنگهای گروه رومانوفسکی، تفکیک دقیق سلولها، درجه رنگ پذیری و رنگ آمیزی تفکیکی گرانولهای سلولهاست که مربوط به دو ترکیب مختلف آن میباشد. با رنگهای رومانوفسکی گروه های اسیدی همچون اسیدهای نوکلئیک، پروتئینهای هستة سلول و ریبوزومها رنگ آزور را به خود می گیرند، در صورتیکه ترکیبات قلیایی مانند هموگلوبین، تمایل زیادی به رنگ های اسیدی همچون ائوزین دارند. گرانولهای سلولهای ائوزینوفیل بعلت داشتن گروه های شدیداً بازی، شدیداً با بخشهای اسیدی رنگ می گیرند، در حالیکه گرانولهای بازوفیلها حاوی هپارین(یک ماده اسیدی) بوده و تمایل به ترکیبات قلیایی دارند. از انواع رنگهای رومانوفسکی میتوان موارد زیر را نام برد: رنگ رایت، رنگ گیمسا، جنر-گیمسا، می گرانولد-گیمسا، لیشمن و...

متداولترین رنگ آمیزی در آزمایشگاهها، رنگ آمیزی گیمسا میباشد. برای رنگ آمیزی گیمسا، بعد از اینکه گسترش خون محیطی را تهیه کردند، اجازه میدهند تا لام کاملاً خشک شود، سپس به کمک الکل متیلیک (متانول) گسترش خون محیطی راfix میکنند. برای این منظور بمدت 5-3 دقیقه لامها را در متانول قرار میدهند. سپس از محلول گیمسای رقیق شده ریخته و بمدت 15 الی30دقیقه صبر میکنند (زمان رنگ آمیزی با گیمسا برحسب غلظت محلول متغیر است). در نهایت لامها را با آب شستشو داده و سپس لام را خشک کرده و زیر میکروسکوپ به بررسی آن می پردازند.


رنگ آمیزی رایت یکی دیگر از روشهای متداول رنگ آمیزی است. در این روش از ماده فیکس کننده استفاده نمی شود، زیرا در زمان تهیه رنگ به آن متانول اضافه شده است.

casper
01/08/2010, 18:59
آزمایش(Complete Blood Count) CBC

آزمایشCBC شامل موارد زیر است:
1) شمارش گلبولهای سفید(WBC Count)
2) شمارش گلبولهای قرمز(RBC Count)
3) اندازه گیری هموگلوبین
4) اندازه گیری هماتوکریت
5) شمارش افتراقی گلبولهای سفید(Differential)
6) بررسی مرفولوژی گلبولهای قرمز
7) امروزه شمارش پلاکتها و اندازه گیری اندیسهای گلبولی شامل MCV ،MCH وMCHC نیز جزء آزمایشCBC محسوب می شود.

اصول شمارش سلولهای خونی
جهت شمارش هر کدام از سلولهای خونی سه مرحله انجام می شود: رقیق کردن خون، برداشتن نمونه از سوسپانسیون رقیق شده، شمارش روی لام شمارش سلولهای خونی(لام هموسیتومتر یا لام نئوبار).
لام شمارش سلولی(هموسیتومتر): معروفترین و متداولترین لام شمارش سلولی، لام نئوبار(Neubauer) میباشد. محفظه شمارش گلبولی در لام نئوبار دارای سطح مربعی شکلی است که طول هر ضلع آنmm3 میباشد، بنابراین کل سطح منطقة شمارش سلولی بهmm²9 بالغ می گردد. چون این سطح به 9 مربع مساوی تقسیم شده است، بنابراین سطح هر یک از این 9 مربع کوچک mm² 1 خواهد بود. جهت سهولت در شمارش نیز هر مربع کوچک1 میلیمتر مربعی، به 16 مربع کوچک تقسیم گشته است. امروزه به جای لام نئوبار معمولی، از لام نئوبار پیشرفته(Improved neubauer) استفاده می شود. این لام، همان لام نئوبار معمولی است که ناحیه مرکزی آن جهت شمارشRBC اصلاح شده است، به این ترتیب که همان تقسیمات فوق در اینجا نیز وجود دارند، ولی مربع مرکزی به جای 16 قسمت، به25 قسمت تقسیم شده است ومجدداً هرکدام از این 25 قسمت به 16 قسمت تقسیم میشوند.
برای شمارش سلولها، جدا از رقیق کردن خون به طریقه ای که بعداً ذکر می شود، بر روی لام نئوبار لامل مخصوصی که به لامل سنگی معروف است قرار می دهیم. با قرار دادن این لامل، فاصله بین لام ولامل و یا به عبارتی بهتر ارتفاع محلولی که بین آنها قرار میگیرد بهmm 1/0 میرسد. برای محاسبه تعداد سلولهای شمارش شده، میانگین تعداد سلولهای موجود درmm² 1 را محاسبه کرده و در10 (به خاطر mm1/0 ارتفاع محلول) و سپس فاکتور رقت (عکس رقت) ضرب میکنیم تا تعداد سلولها در میلیمتر مکعب(mm³) محاسبه شود.

شمارشRBC :
خون توسط یک محلول ایزوتونیک مانندHayem ،Gower وLewis-Dacie به نسبت200/1 رقیق می شود وسپس تعداد گلبولهای قرمز در5 مربع از25 مربع مرکزی لام نئوبار پیشرفته شمارش میشود:
10000× تعداد = 200 ×10 × 5 × تعداد شمارش شدهÞ محاسبه

شمارشWBC : خون توسط یک محلول اسیدی مانند محلول مارکانو یا محلول تورک به نسبت20/1 رقیق می شود. در این محلول اسیدی گلبولهای قرمز لیز شده ولی به گلبولهای سفید و سایر گلبولهای هسته دار(مانندگلبول قرمز هسته دار :NRBC ) آسیبی نمی رسد. در محلول رقیق کننده یک ماده رنگی مانند کریستال ویوله وجود دارد تا دیدن هسته سلولها آسانتر باشد. شمارش گلبولهای سفید در چهار مربع کناری لام نئوبار صورت می گیرد.
50 × تعداد = 20 × 10 × (4 ÷ تعداد شمارش شده) Þ محاسبه

شمارش پلاکت : خون توسط محلول اگزالات آمونیوم1% به نسبت100/1 رقیق می شود. اگزالات آمـــونیوم موجب تخریب گلبولهای سفید و قرمز می شود. شمارش پلاکتهادر ناحیة شمارش RBC صورت میگیرد. لازم به ذکر است بعداز پُرشدن محفظة شمارش، باید لام نئوبار را جهت ساکن شدن پلاکتها، 20 دقیقه بدون حرکت در یک محفظه مرطوب قرار داد.
دو روش دیگر برای شمارش پلاکتها وجود دارد:
1- با عدسی روغنی (100)، هزار عدد RBC را شمرده و پلاکتها را نیز می شماریم. با توجه به تعدادRBC های فرد با تناسب تعداد پلاکت رامحاسبه می کنیم. برای مثال اگر تعداد پلاکت شمارش شده به ازاء هزارRBC ، 100عدد باشد وتعداد گلبولهای قرمز فردmm²4800000 باشد:
480000 = 1000 ÷ (4800000 × 100) = تعداد پلاکت

2- حداقل در 10 فیلد میکروسکوپی تعداد پلاکتها را شمرده، میانگین گرفته و در عدد10هزار ضرب میکنیم. مثلاً اگر در 10 فیلد،200 عدد پلاکت شمارش کردیم:
200000 = 10000 × 20 Þ 20 = 10 ÷ 200
** برای شمارش گلبولهای سفید و قرمز در لام نئوبار، از عدسی10و برای شمارش پلاکتها در لام نئوبار از عدسی40 استفاده می کنیم.

شمارش رتیکولوسیت: گلبولهای قرمز جوان را رتیکولوسیت می نامند. در شمارش رتیکولوسیت، خون با نسبت مساوی با محلول شمارش برلیانت کرزیل بلو یا متیلن بلو مخلوط می شود، مدتی در37 درجه قرار میگیرد وسپس از آن اسمیر تهیه می شود. تعداد رتیکولوسیتها را به ازاء هزار عددRBC شمارش کرده و درصد آن گزارش می شود. در فرد بالغ طبیعی حدود 5/1-5/0 درصد RBC ها را رتیکولوسیتها تشکیل میدهند. به رنگ آمیزی ذرات داخل سلولی در حالیکه سلولها زنده هستند، رنگ آمیزی حیاتی(Vital staining) می گویند. اگر سلولهای زنده را پس از خارج کردن از بدن رنگ آمیزی کنیم، به آنSupravital staining می گویند، که رنگ آمیزی رتیکولوسیتها از این نوع میباشد.
از آنجاییکه جواب شمارش رتیکولوسیتها بصورت درصد بیان می شود، اگر تعداد کلRBC های بیمار کاهش یافته باشد، حتی در صورت ثابت بودن تعداد واقعی رتیکولوسیتها، این نسبت به طور کاذب افزایش نشان خواهد داد. جهت رفع این اشکال می توان جواب را بصورت درصد بیان کرد، ولی مقدار آنرا بر حسب تعداد کلRBC بیمار تصحیح کرد:
HCTنرمال/HCT بیمار×Retic% =Corrected Reticulocyte Count
برای مثال در بیماری که دچار آنمی همولیتیک است اگر شمارش رتیکولوسیتها20% و 25%HCT= باشد:
11% = 45¸ 25 ×20 =CRC
از طرف دیگر با تحریک مغز استخوان جهت ساخت RBC ها، رتیکولوسیتها زودتر از موعد مقرر وارد خون محیطی شده و در نتیجه بخش بیشتری از طول عمر سه روزه خود را (دو روز در مغز استخوان ویک روز در خون محیطی) در خون محیطی خواهند گذراند، که این مسئله نیز درصد رتیکولوسیتها را به طور کاذب بیش از حد واقعی نشان خواهد داد. طبق محاسبات صورت گرفته، هر چقدرHCT بیمار کمتر باشد، رتیکولوسیتها مدت بیشتری از طول عمر خود را در خون محیطی خواهند گذراند.
به جهت اصلاح این امر نیز می توان معیار صحیحتری از فعالیت خونسازی بیمار بدست آورد. عدد بدست آمده را اندکس تولید رتیکولوسیت می نامند که به طریق زیر محاسبه می شود:
) × (patient HCT ÷ normal HCT)طول عمر در خون ÷ RPI = (Retic%
مثال: در بیماری که قبلاً ذکر شد طول عمر رتیکولوسیت در خون محیطی2 روز است، پس: 5/5 = (45% ÷ 25% ) × (2 ÷ 20) RPI =
*با قرار دادن ابزاری بنام دیسکMiller در عدسی چشمی می توان راحتتر شمارش را انجام داد.
* در نوزادان در48 ساعت اول بعد از تولد مقدار رتیکولوسیت بیش از بالغین بوده و تا7% می رسد. این مقدار پس از دو هفته به مرور کاهش می یابد.
* در مواردیکه خونسازی خیلی زیاد شود، علاوه بر ازدیاد رتیکولوسیتها، ممکن استNRBC نیز زیاد شود. در این صورت هنگام شمارشWBC ، NRBC در محلول شمارش مارکانو لیز نمی شود، در نتیجه با WBC شمارش شده و بنابراین بایستی شمارشWBC اصلاح شود. برای مثال اگر در لام نئوبار11400 عدد سلول شمارش شود، این مقدار کلWBC و NRBC می باشد. حال شمارش افتراقی گلبولهای سفید را انجام میدهیم، و در کنار این100 عدد، تعدادNRBC مشاهده شده را می شماریم (مثلاً14 عدد). سپس با یک تناسب تعدادNRBC را محاسبه می کنیم:


NRBC هسته دار



14 114


* 11400



10000 = 1400 – 11400 X 1400 = x



اصول اندازه گیری هموگلوبین: معروفترین روش اندازه گیری هموگلوبین روش سیانومتهموگلوبین میباشد.در این روش خون به نسبت1/251 در محلول درابکین رقیق میشود، لذا کلیه ترکیبات هموگلوبین مانند HbCO2 ، HbCO و... به جـــزSHb (سولفوهموگلوبین) به هموگلوبین سیانید (HiCN) تبدیل میگردند که یک ترکیب رنگی است و جذب نوری آن در طول موج nm540 قرائت شده و مقدار هموگلوبین محاسبه می گردد.